Когда зима накрывает мир, окутывая дни туманом и покрывая землю слоем инея, люди прячутся в домах, укутавшись в уютные пледы. Под потрескивание обогревателей они наслаждаются горячим шоколадом, чтобы согреться. Однако не все животные на планете могут позволить себе такую роскошь. Они придумали другие способы выжить в условиях низких температур.

Некоторые лягушки прибегают к необычному способу: лесные лягушки (Rana sylvatica) и серые квакши Коупа (Dryophytes chrysoscelis) зарываются в опавшие листья на лесной подстилке, что обеспечивает некоторую защиту от холода. Однако при температуре ниже нуля градусов по Цельсию у земноводных замерзает до 65 % воды в организме, они становятся метаболически неактивными и не проявляют признаков сердцебиения, дыхания или нервной проводимости.

Древесные лягушки зимой впадают в спячку.Раша Аль-Аттар

«По всем параметрам это животное клинически мертво», — сказала Шеннон Тессье, чьи исследования в Массачусетской больнице общего профиля (MGH) направлены на использование природных механизмов в биомедицине.

При замерзании лягушки становятся твёрдыми. «Если взять в руки замороженную лягушку, она будет буквально как камень», — говорит Раша Аль-Аттар, биолог, работающая в лаборатории Тессье в Массачусетской больнице общего профиля. Когда зима сменяется весной и температура повышается, замороженные земноводные постепенно оттаивают «и продолжают заниматься [своими] делами, как будто ничего не произошло», — добавляет Аль-Аттар.

Вдохновившись природными свойствами лягушек, не замерзающих на морозе, учёные стали изучать, как можно использовать тактику выживания лягушек для более эффективного сохранения человеческих клеток, тканей и органов. Это особенно важно для улучшения результатов трансплантации, а также для того, чтобы у врачей было больше времени на распределение пригодных для трансплантации тканей и органов по разным регионам. На самом деле, тестирование некоторых процессов, заимствованных у морозоустойчивых лягушек, позволило продлить срок криоконсервации некоторых органов животных, что является многообещающим доказательством в поддержку стратегий криоконсервации органов, вдохновлённых природой.

Современные проблемы и возможности криоконсервации

Миллионы людей по всему миру страдают от терминальной стадии органной недостаточности. В США около 13 человек умирают каждый день в ожидании жизненно важной операции по пересадке органов; более 100 000 человек стоят в очереди на получение органа, которая пополняется на одного человека каждые восемь минут.

Одной из основных проблем, препятствующих проведению большего количества операций по трансплантации, является нехватка доступных органов, которая усугубляется тем, что их нельзя хранить в течение длительного времени. В настоящее время наиболее распространённым методом хранения изъятых органов является статическое охлаждение. «Вы кладёте орган в пакет со льдом и бежите к реципиенту. У вас есть всего несколько часов», — объяснил Коркут Уйгун, инженер-химик и системный инженер в MGH.

Уйгун, Тонер и их команды работают с печенью грызунов, изучая влияние стратегий криоконсервации, заимствованных из природы. На фото — печень крысы перед заморозкой при температуре -15 °C. Кэтрин А. Флок, Кейси Пендекстер/Массачусетс, генерал Бригам

«Органы живут [в человеческом теле] 70, 80, 90 лет. Вы их извлекаете, [и] через шесть часов [они] говорят: «Я ухожу, меня больше нет», — сказал Мехмет Тонер, инженер-биомедик из Массачусетской больницы общего профиля. Это означает, что все операции по трансплантации органов проводятся в экстренном порядке, по мере поступления органов, которые либо жертвуют живые люди, либо извлекают у умерших в результате остановки сердца или дыхания. «По сути, у нас нет ни логистики, ни цепочки поставок органов», — сказал Уйгун.

Тонер и Уйгун надеются решить эту проблему. Они изучают способы продления срока хранения изъятых органов, чтобы их можно было пересаживать пациентам по мере необходимости, подобно тому, «как вы можете купить что-то на Amazon с доставкой на дом», — сказал Уйгун.

С этой целью исследователи опираются на работу Тессье и других учёных, изучающих животных, которые выработали гениальные способы замедления биологических процессов, например морозоустойчивых лягушек. «Учёные всегда ищут ответы в природе, — говорит Тонер. — И за миллиарды лет природа нашла решение». Например, тот факт, что лягушки могут оттаивать после заморозки без каких-либо повреждений, может дать важную информацию о том, как уменьшить последствия ишемического/реперфузионного повреждения, которое неизбежно возникает после трансплантации органа: кровь внезапно поступает в орган, который не получал кровоснабжения во время консервации и транспортировки, запуская иммунный каскад, который может привести к дисфункции или отторжению трансплантата.

Как лягушки переносят многократные циклы замораживания и оттаивания

Чтобы выяснить, как лягушки переживают многократные циклы замораживания и оттаивания в течение года, учёные собирают этих животных, кладут их на влажные бумажные полотенца в пластиковых контейнерах и замораживают. «Как только на влажном бумажном полотенце образуется лёд, он распространяется по коже древесной лягушки, и она замерзает», — говорит Аль-Аттар. Это замедляет метаболические процессы и приводит к замерзанию большей части воды в организме во внеклеточном пространстве. «А потом, когда мы захотим их разморозить, мы просто достанем их, положим в холодильник с температурой четыре градуса, а затем вынем и поставим в комнату», — объяснил Аль-Аттар.

Биохимические и физиологические исследования позволили лучше понять, как лягушки приспосабливаются к жизни в условиях низких температур. Например, измерив концентрацию различных молекул в замороженных серых квакшах, учёные обнаружили, что эти животные накапливают глицерин.

«На самом деле глицерин [обеспечивает] криозащиту клеток от физического воздействия при замораживании и оттаивании», — говорит Карисса Крейн, биолог, изучающая устойчивость к низким температурам у серых квакш Коупа в Дейтонском университете. Микроскопическое исследование клеток животных, акклиматизированных к холоду и теплу, выявило некоторые различия: при добавлении воды в суспензию первые лопались реже, чем вторые. «Они действительно хорошо переносят такое осмотическое давление», — говорит Крейн. Она объяснила, что глицерин проникает через клеточные мембраны, поддерживая осмотическое давление, которое не даёт воде проникать в клетки, когда животные оттаивают при более высокой температуре.

Чтобы лучше понять, как лягушки накапливают глицерин при воздействии холода, Крейн и её команда провели секвенирование РНК клеток печени земноводных на разных стадиях замораживания и оттаивания. Они обнаружили снижение экспрессии гена, кодирующего фермент, который метаболизирует глицерин, что, возможно, способствует накоплению криопротектора.

«Одна из причин, по которой этот организм представляет для нас такой интерес, заключается в том, что глицериновый механизм, как было показано в других системах, является очень хорошим криопротектором», — сказал Крейн. Например, исследователи используют глицерин для хранения микроорганизмов при отрицательных температурах и для криоконсервации спермы животных в рамках вспомогательных репродуктивных технологий, что свидетельствует о перспективности таких стратегий, вдохновлённых лягушками.

В отличие от серых квакш, древесные лягушки используют глюкозу в качестве основного криопротектора. Они накапливают глюкозу в организме, приостанавливая метаболические процессы, в ходе которых происходит усвоение этой молекулы.

Кроме того, поздней осенью у лесных лягушек происходит ряд адаптаций, которые помогают им пережить зиму. Они накапливают гликоген, который служит им топливом, изменяют клеточные мембраны, чтобы предотвратить разрушение клеток, и увеличивают количество антиоксидантов для борьбы с окислительным повреждением. Животные также замедляют свой метаболизм, чтобы использовать накопленную энергию только для процессов, абсолютно необходимых для выживания.

Хотя некоторые из этих механизмов хорошо изучены на примере лягушек, «не совсем понятно, как добиться того же у человека или другого животного, не обладающего устойчивостью к низким температурам», — говорит Тессье. Поэтому исследователи опираются на данные сравнительной биологии, а также применяют принципы химии и инженерии, чтобы наделить клетки, не обладающие устойчивостью к низким температурам, соответствующими свойствами. «Мы пытаемся перенять эти знания у природы, но не обязательно воспроизводить их в точности».

Стратегии криоконсервации на основе лягушек показывают многообещающие результаты

Учёные обрабатывают печень крысы криопротекторами, чтобы предотвратить повреждения при заморозке. Кэтрин А. Флок, Кейси Пендекстер/ Массачусетская больница общего профиля

Ученые начали применять некоторые знания, полученные при изучении лягушек, к системам млекопитающих.

Например, у лягушек лёд образуется преимущественно во внеклеточном пространстве, а не внутри клеток. Опираясь на это, Тессье, Тонер и их коллеги выделили продукт бактериального происхождения, который помог им контролировать образование льда во внеклеточной сосудистой системе при криоконсервации клеток.

Вдохновившись способностью древесных лягушек накапливать глюкозу в качестве криопротектора, Тонер и Уйгун продолжили исследования в том же направлении. «[Однако] глюкоза в клетках млекопитающих токсична в тех концентрациях, которые нам нужны», — сказал Тонер. Поэтому исследователи обратились к аналогу глюкозы, химическая модификация которого не позволяет клеткам млекопитающих усваивать его.

Используя этот метод, исследователи смогли улучшить жизнеспособность клеток печени крыс после их размораживания. Аналог наряду со стратегиями переохлаждения и реперфузии также продлевал криоконсервацию печени крыс на срок до четырех дней. Исследователи также успешно пересадили свиную почку, которую криоконсервировали более недели, используя некоторые стратегии, вдохновленные природой.

Используя некоторые стратегии, заимствованные из природы, Уйгун и его команда недавно смогли сохранить свиную почку в замороженном состоянии в течение 10 дней. Джеффри Андри, Кейси Пендекстер, Маклин Таггарт/ Массачусетская больница общего профиля

Хотя аналог глюкозы оказывает криопротекторное действие, не вызывая токсичности, не все криопротекторы можно использовать таким образом. Поэтому Аль-Аттар изучает подходы на основе синтетической биологии и временное редактирование генов, чтобы повысить устойчивость клеток и снизить токсичность криопротекторных агентов, таких как диметилсульфоксид, который используется для сохранения клеточных линий млекопитающих.

Но криопротекторы — это лишь одна из линий защиты клеток от побочных эффектов заморозки. Помимо мобилизации таких молекул, у замороженных лягушек значительно замедляется метаболизм. Исходя из этого, Тонер и его коллеги обработали несколько линий клеток млекопитающих препаратом, подавляющим биосинтетические процессы, и наблюдали повышение жизнеспособности после разморозки.

Будущее стратегий криоконсервации органов, вдохновленных природой

Несмотря на то, что отдельные стратегии обещают определенные перспективы, Уйгун отметил, что для достижения устойчивости к замораживанию необходимо объединить несколько мероприятий. “Не существует волшебной молекулы, [куда] вы добавляете что-то одно, и все [становится] решенным”, - отметил он. “Это должно быть организовано, потому что так действительно делает природа". Есть какая-то координация, какая-то хореография”.

Врачи восстанавливают свиную почку после разморозки непосредственно перед трансплантацией свинье-реципиенту. Джеффри Андри, Кейси Пендекстер, Маклин Таггарт/ Массачусетская больница общего профиля

Крейн согласился с тем, что отдельные виды, устойчивые к низким температурам, помогли нам лучше понять этот процесс. «Наша задача — собрать всё воедино... объединить все эти данные из множества различных моделей».

Несмотря на трудности и масштабность предстоящей задачи, Уйгун отметил, что окружающая среда идеально подходит для того, чтобы использовать уроки природы для улучшения результатов трансплантации. По его словам, врачи в целом положительно относятся к таким стратегиям продления жизни донорских органов, что является многообещающим признаком для трансплантационной медицины.

«Через пять лет ситуация с трансплантацией будет совсем другой», — соглашается Тонер.

Тессье, Тонер и Уйгун были поражены тем, что подобные стратегии, вдохновлённые природой, однажды позволят хирургам-трансплантологам выбирать из каталога криоконсервированных органов. «Это было бы просто замечательно», — сказал Тессье.